Kościół prawosławny stanowił drugi co do wielkości Kościół chrześcijański na obszarze Rzeczypospolitej. Na jego pozycji negatywnie odbił się przede wszystkim upadek Cesarstwa Bizantyjskiego. Ponadto prawosławiu zagrażały również postępy reformacji. Dodatkowo w sytuacji, kiedy szlachta ruska porzucała wyznania reformowane, to w większości przypadków robiła na rzecz katolicyzmu.
Utrata elit społecznych była dla wyznawców prawosławia poważnym problemem zwłaszcza, że Kościół wschodni przeżywał poważny kryzys w XVI w., który dodatkowo był pogłębiany brakiem szkół. Sytuacja Cerkwi w Rzeczypospolitej zaczęła się zmieniać pod koniec XVI stulecia.
Istotną rolę odegrała wówczas prawosławna akademia w Ostrogu, założona w roku 1580 – jej założycielem był wojewoda kijowski, książę Konstanty Wasyl Ostrogski. Szkoła ta – wraz z bractwem cerkiewnym oraz częścią hierarchii prawosławnej, podjęła działania na rzecz odnowy Cerkwi.
Z biegiem czasu narodził się projekt wzmocnienia Cerkwi w Rzeczypospolitej. Miano tego dokonać poprzez zjednoczenie jej z Kościołem katolickim przy zachowaniu prawosławnej liturgii, małżeństw księży oraz wprowadzenia biskupów do senatu.
Plany te były popierane przez jezuitów, nuncjuszy papieskich oraz króla Zygmunta III Wazę. Po długich rokowaniach, prowadzonych jedynie z gronem hierarchów prawosławnych, doszło w roku 1563 w Brześciu Litewskim do zawarcia unii między dwoma Kościołami – Unia Brzeska.
Na mocy tego porozumienia, w zamian za przyjęcie dogmatów katolickich i uznanie papieża głową Kościoła, unici – zwani odtąd grekokatolikami, całkowicie zachowali swoją liturgię i jej język, kalendarz juliański, małżeństwa księży oraz dopuszczenie biskupów unickich do senatu. Ten ostatni zamysł nigdy nie został zrealizowany. Natychmiast po zawarciu unii pojawiły się sprzeczności wśród prawosławnych biskupów oraz duchowieństwa.
Pomimo, iż nowy Kościół unicki pozyskał większość hierarchii prawosławnej w państwie polsko – litewskim, to nie udało mu się uzyskać tego samego pośród wyznawców Kościoła prawosławnego.
Prawosławie w ówczesnym czasie znalazło swoich obrońców głównie wśród Kozaków. Konflikt religijny z resztą stał się jedną z przyczyn powstań kozackich. Kozacy wysuwali odtąd na czoło swoich haseł w walce z Rzeczpospolitą – obronę prawdziwej religii greckiej.
Opór przeciwko unii był najsilniejszy w południowo – wschodniej części Rzeczpospolitej. Z drugiej strony zwolennicy unii brzeskiej koncentrowali się na obszarze Wielkiego Księstwa Litewskiego. Unia więc nie przyniosła spodziewanych rezultatów – politycznych oraz religijnych.