Sakrament Eucharystii został ustanowiony przez Jezusa podczas Ostatniej Wieczerzy, czyli tej nocy, której Chrystus został wydany. Jezus wiedział, że zbliża się dzień Jego śmierci, postanowił zatem zostawić swoim uczniom dowód miłości i równocześnie pamiątkę swej Męki i Zmartwychwstania. Polecił ją Apostołom celebrować aż do dnia swojego powtórnego przyjścia (1 Kor 11,26).
Opis ustanowienia Eucharystii znajduje się w Ewangeliach synoptycznych (Mt 26, 17-35; Mk 14, 12-25; Łk 22, 7-20) oraz w 1. Liście do Koryntian (1 Kor 11,17-34). Z kolei św. Jan przytacza słowa Jezusa wypowiedziane w synagodze w Kafarnaum, przygotowujące do ustanowienia Eucharystii (mowa Eucharystyczna - J 6,22-71).
Fragment z Ewangelii św. Mateusza:
A gdy oni jedli, Jezus wziął chleb i odmówiwszy błogosławieństwo, połamał i dał uczniom, mówiąc: «Bierzcie i jedzcie, to jest Ciało moje». Następnie wziął kielich i odmówiwszy dziękczynienie, dał im, mówiąc: «Pijcie z niego wszyscy, bo to jest moja Krew Przymierza, która za wielu będzie wylana na odpuszczenie grzechów. Lecz powiadam wam: Odtąd nie będę już pił z tego owocu winnego krzewu aż do owego dnia, kiedy pić go będę z wami nowy, w królestwie Ojca mojego». Po odśpiewaniu hymnu wyszli ku Górze Oliwnej. (Mt 26,26-30)
Warto zaznaczyć, że do ustanowienia Eucharystii doszło w czasie Paschy, czyli święta żydowskiego (hebr. Pesach) obchodzonego na pamiątkę wyzwolenia Żydów z niewoli egipskiej. Kościół naucza, że celebrując Ostatnią Wieczerzę Jezus wypełnił w sposób ostateczny Paschę żydowską.