Po wygaśnięciu panującej w Czechach dynastii Przemyślidów, na nowego władcę wybrano syna cesarza Henryka VII – Jana Luksemburskiego (1310 – 1346). Początkowo nowy władca popierał niemieckie mieszczaństwo oraz kolonistów. Jednak na skutek wojny z czeskimi możnowładcami i rycerstwem, zawarł z nimi ugodę w roku 1318. Na jej mocy pozbył się wówczas niemieckich doradców oraz zrezygnował z wojsk najemnych pochodzących z tego kraju.
Jan Luksemburski w roku 1311 zwolnił od podatków świeckich i duchownych feudałów oraz ograniczył obowiązek stawiania się na wojnę, gdy będzie się ona toczyć w granicach państwa. Prawo do obejmowania urzędów i majątków na terenie Czech i Moraw, nadano tylko i wyłącznie stałym mieszkańcom tych obszarów. W efekcie, w okresie panowania Jana Luksemburczyka, uformowały się stany czeskie.
Pierwszy przedstawiciel nowo panującej dynastii w Czechach zhołdował piastowskich książąt Śląska i włączył te dzielnice do królestwa czeskiego. Zgłaszał również pretensje do tronu oraz ziem polski, jako następca po Wacławie II. W swoich dążeniach zwalczał Władysława Łokietka, działając w sojuszu z krzyżakami.
Następca Jana – Karol IV (1346 – 1378), założył Uniwersytet w stolicy, który później nazwano jego imieniem. Rozbudował liczne miasta, w szczególności Pragę, dbał przy tym o ogólny rozwój kraju. W XIV w. język czeski uzyskał pozycje języka międzynarodowego, a Pismo Święte zostało przetłumaczone już w roku 1360.
Za jego panowania do Czech przyłączono Dolne Łużyce, Brandenburgię oraz księstwa śląskie, świdnickie i jaworskie. Na mocy Złotej bulli z roku 1356, król Czech został jednym z elektorów Rzeszy. Do królestwa czeskiego w tym okresie nadal napływali Niemcy, a poszczególne dominia czeskie integrowały się gospodarczo z sąsiednimi ziemiami niemieckimi.
Ówczesna intensywna kolonizacja niemiecka oraz germanizacja części rycerstwa i duchowieństwa, doprowadziły do napięć na tle etnicznym i językowym. Czechy w tym okresie stanowiły kraj niejednolity etnicznie, co prowadziło do sprzeciwów wobec silnych wpływów niemieckich.
Uczucia wobec zaistniałej sytuacji oraz dążenia ludności wyrażał w swych kazaniach profesor uniwersytetu praskiego – Jan Hus. Wszystkie jego poglądy zostały uznane za heretyckie, ponieważ zwrócił się przeciwko świeckiej władzy papieża, kupowania odpustów oraz żądał komunii dla wszystkich wiernych pod postacią chleba i wina.
Jana Husa wezwano do Konstancji na sobór powszechny. Pomimo, że miał on zapewnione bezpieczeństwo przez cesarza, osądzono go i jako heretyka w roku 1415 spalono na stosie.
Jego śmierć wywołała w Czechach bunt poddanych. Następca Karola Luksemburskiego – Zygmunt, nie mogąc objąć w tej sytuacji tronu prowadził – przy wsparciu papieża Marcina V, krucjaty przeciwko husytom.
Wojny prowadzone przez zwolenników nauk Jana Husa skierowane przeciwko niemieckiemu władcy – Zygmuntowi Luksemburczykowi, nazwano wojnami husyckimi. Trwały one w latach 1419 – 1434, rozpoczynając się od buntu ludności w Pradze po śmierci Husa. Kolejne wyprawy zbrojne Zygmunta kończyły się klęskami jego sił. On sam koronował się w Pradze dopiero pod koniec swojego życia.